Synaptojanin 1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-430506-ACT

Synj1 codifica la sinaptojanina 1, una fosfatasi dei polifosfoinositidi che idrolizza PI(4,5)P2 e fosfoinositidi correlati per regolare il traffico di membrana. Nei neuroni, la sinaptojanina 1 coordina l’endocitosi mediata da clatrina e il riciclo delle vescicole sinaptiche, accoppiando il turnover dei fosfoinositidi allo smontaggio del rivestimento (coat) e al rimodellamento dell’actina. Questa attività si interseca con lo smistamento endosomiale e con dinamiche di membrana rilevanti per l’autofagia, che modellano la funzione presinaptica e la proteostasi. Un’attività alterata di SYNJ1 è stata collegata alla biologia delle malattie neurodegenerative e dei disturbi del movimento, rendendolo un nodo utile per studiare le vie di mantenimento sinaptico in condizioni di stress.

Synaptojanin 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Synj1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Synaptojanin 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Synj1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Synj1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Synaptojanin 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Synj1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Synaptojanin 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Synaptojanin 1 nelle cellule tumorali con espressione di Synj1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.