SUR-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401540-ACT

ABCC8 codifica il recettore delle sulfoniluree 1 (SUR-1), una subunità regolatoria della sottofamiglia C delle cassette leganti l’ATP (ABC) dei canali del potassio sensibili all’ATP (KATP), che collegano lo stato energetico cellulare all’eccitabilità di membrana. Nelle cellule β pancreatiche, SUR-1 si associa a KCNJ11 per controllare il gating dei canali KATP, modulando la depolarizzazione indotta dal glucosio, l’ingresso di Ca2+ e l’esocitosi dei granuli di insulina. Oltre alla segnalazione endocrina, i canali KATP contenenti SUR-1 contribuiscono alla regolazione elettrofisiologica nei tessuti eccitabili tramite il sensing metabolico e l’omeostasi ionica. Le variazioni genetiche o la disregolazione di ABCC8 sono associate a disturbi della secrezione di insulina e dell’omeostasi del glucosio, rendendolo un bersaglio frequente per studi meccanicistici in modelli di malattie metaboliche.

SUR-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ABCC8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SUR-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ABCC8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ABCC8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SUR-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ABCC8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SUR-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SUR-1 nelle cellule tumorali con espressione di ABCC8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.