SR-2C Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400886-ACT

HTR2C codifica il recettore umano della 5-idrossitriptamina 2C (SR-2C), un recettore accoppiato a proteine G che segnala principalmente attraverso Gq/11 per attivare la fosfolipasi C, aumentare la mobilizzazione intracellulare di Ca2+ e innescare cascate di fosforilazione dipendenti da PKC. SR-2C influenza inoltre la segnalazione MAPK/ERK e regola il rilascio di neurotrasmettitori modulando l’eccitabilità neuronale e la trasmissione sinaptica nei circuiti serotoninergici. Attraverso queste vie, HTR2C contribuisce al controllo centrale dell’appetito, dell’umore e degli output endocrini/autonomici, e la sua disregolazione è stata associata a fenotipi neuropsichiatrici e metabolici in studi sperimentali e genetici. Queste caratteristiche rendono HTR2C un bersaglio utile per indagare la dinamica della segnalazione dei GPCR, gli effetti dell’editing del recettore/delle isoforme e il crosstalk tra vie di segnalazione in modelli cellulari neuronali e neuroendocrini.

SR-2C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HTR2C senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SR-2C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HTR2C nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HTR2C, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SR-2C. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HTR2C nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SR-2C nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SR-2C nelle cellule tumorali con espressione di HTR2C silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.