SP-B Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422901-ACT

Sftpb codifica la proteina del surfattante B (SP-B), un componente idrofobico del surfattante polmonare necessario per l’impacchettamento e la distribuzione dei fosfolipidi che stabilizzano la tensione superficiale alveolare durante la respirazione. Nelle cellule epiteliali alveolari di tipo II del topo, SP-B viene processata a partire da una proproteina e indirizzata attraverso le vie secretorie e dei corpi lamellari per sostenere l’omeostasi del surfattante e la compliance polmonare. L’attività di Sftpb è strettamente legata ai programmi di differenziazione epiteliale e ai processi di gestione dei lipidi che coordinano la biogenesi e il turnover del surfattante. Un’espressione o un processamento alterati di SP-B sono associati a una funzione del surfattante compromessa e a fenotipi rilevanti per l’insufficienza respiratoria neonatale, la patologia polmonare interstiziale e la suscettibilità al danno alveolare in modelli sperimentali.

SP-B Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Sftpb senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SP-B Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Sftpb nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Sftpb, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SP-B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Sftpb nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SP-B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SP-B nelle cellule tumorali con espressione di Sftpb silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.