SmcY Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403217-ACT

KDM5D codifica la demetilasi della lisina SmcY (JARID1D), legata al cromosoma Y, un regolatore della cromatina che rimuove i segni H3K4me2/3 per modulare i programmi trascrizionali. Attraverso il suo ruolo nel controllo epigenetico, SmcY contribuisce al mantenimento dell’identità cellulare, alla regolazione dell’espressione genica associata alla proliferazione e al coordinamento dello stato della cromatina con processi guidati dal DNA come la replicazione e la riparazione. Un’attività alterata della famiglia KDM5 è stata implicata in reti trascrizionali deregolate in contesti tumorali e dello sviluppo, e la stessa KDM5D è spesso studiata in relazione alla biologia sesso-specifica e alla perdita del cromosoma Y nei tessuti somatici. Queste caratteristiche rendono KDM5D un modello utile per indagare come la demetilazione degli istoni influenzi gli output delle vie di segnalazione e i fenotipi cellulari.

SmcY Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KDM5D senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SmcY Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KDM5D nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KDM5D, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SmcY. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KDM5D nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SmcY nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SmcY nelle cellule tumorali con espressione di KDM5D silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.