Smchd1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-428851-ACT

Smchd1 (structural maintenance of chromosomes flexible hinge domain containing 1) è un regolatore epigenetico che sostiene l’organizzazione della cromatina di ordine superiore e il silenziamento genico a lunga distanza nelle cellule di topo. La proteina SMCHD1 contribuisce alla repressione stabile di specifiche regioni genomiche, incluse quelle associate all’inattivazione del cromosoma X e ad altri programmi di silenziamento dipendenti dal contesto, collegandola al controllo trascrizionale e all’architettura della cromatina. Attraverso effetti sulla metilazione del DNA, sui paesaggi delle modificazioni istoniche e sulla compattazione della cromatina, Smchd1 influenza la regolazione genica nello sviluppo e stati di espressione specifici di linea cellulare. La disregolazione della repressione dipendente da SMCHD1 è stata associata ad alterazioni degli stati della cromatina rilevanti per fenotipi dello sviluppo e per i meccanismi di malattie neuromuscolari, rendendola un bersaglio utile per studi di genomica funzionale del controllo epigenetico.

Smchd1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Smchd1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Smchd1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Smchd1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Smchd1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Smchd1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Smchd1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Smchd1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Smchd1 nelle cellule tumorali con espressione di Smchd1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.