SLC12A8 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-431364-ACT

Slc12a8 codifica SLC12A8, un membro della famiglia dei trasportatori solute carrier 12 (SLC12) accoppiati a cationi, che regola i gradienti ionici di membrana e contribuisce all’omeostasi osmotica epiteliale e cellulare. Attraverso la modulazione del flusso accoppiato di Na⁺/K⁺/Cl⁻ e delle correlate forze motrici elettrochimiche, SLC12A8 può influenzare il controllo del volume cellulare, i processi di trasporto transepiteliale e la segnalazione a valle collegata a vie metaboliche e di risposta allo stress. Un’attività alterata dei trasportatori SLC12 è spesso associata a squilibri elettrolitici e a perturbazioni della fisiologia tissutale, rendendo Slc12a8 un bersaglio utile per studiare meccanismi dipendenti dai trasportatori in condizioni normali e in contesti rilevanti per la malattia. Nei modelli murini, la regolazione di Slc12a8 può essere sfruttata per studiare come il trasporto ionico si integri con la funzione di barriera, l’infiammazione e l’adattamento metabolico.

SLC12A8 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Slc12a8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SLC12A8 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Slc12a8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Slc12a8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SLC12A8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Slc12a8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SLC12A8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SLC12A8 nelle cellule tumorali con espressione di Slc12a8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.