Six3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404026-ACT

Il gene umano **SIX3** codifica il fattore di trascrizione homeobox Six3, un regolatore principale del patterning della placca neurale anteriore e dello sviluppo precoce dell’encefalo anteriore e dell’occhio. Six3 agisce come proteina legante il DNA in modo specifico per la sequenza e coordina programmi trascrizionali che controllano la proliferazione dei progenitori, la differenziazione neuronale e l’identità regionale, con collegamenti ben documentati alla cross-regolazione tra le vie di segnalazione Wnt/β-catenina e Sonic hedgehog (SHH) durante il neurosviluppo. Un dosaggio alterato di SIX3 o una sua attività regolatoria modificata sono associati a malformazioni congenite, tra cui l’oloprosencefalia e difetti dello sviluppo oculare, rendendolo un nodo di grande interesse per lo studio delle reti regolatorie geniche dello sviluppo. Nei modelli cellulari, la perturbazione di SIX3 viene utilizzata per indagare le transizioni dello stato della cromatina, la logica degli enhancer e le dinamiche di specificazione di linea rilevanti per la biologia del neurosviluppo.

Six3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SIX3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Six3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SIX3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SIX3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Six3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SIX3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Six3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Six3 nelle cellule tumorali con espressione di SIX3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.