Shc Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400914-ACT

SHC1 codifica la proteina adattatrice Shc, un trasduttore centrale dei segnali che collega le tirosin-chinasi recettoriali attivate e i recettori per le citochine a cascate a valle, tra cui RAS–MAPK/ERK e PI3K–AKT. Attraverso i domini PTB e SH2, Shc coordina l’assemblaggio, dipendente dalla fosforilazione, di complessi di segnalazione che regolano proliferazione, differenziamento, sopravvivenza e risposte cellulari allo stress. La segnalazione dipendente da SHC1 interagisce anche con le vie dell’insulina/IGF e influenza la segnalazione mitocondriale e dello stress ossidativo, contribuendo a cambiamenti contestuali nella crescita cellulare e nell’apoptosi. Una disregolazione della segnalazione SHC1/Shc è stata associata ad attività anomala delle vie dei fattori di crescita nella biologia dei tumori e a dinamiche di segnalazione alterate in modelli di ricerca sul metabolismo e sulla neurodegenerazione.

Shc Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SHC1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Shc Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SHC1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SHC1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Shc. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SHC1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Shc nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Shc nelle cellule tumorali con espressione di SHC1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.