Sel-1L Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403861-ACT

SEL1L codifica Sel-1L, un componente fondamentale del macchinario di degradazione associata al reticolo endoplasmatico (ERAD) che, in collaborazione con HRD1, riconosce, retrotrasloca e favorisce l’eliminazione proteasomiale ubiquitina-dipendente di proteine secretorie e di membrana ripiegate in modo scorretto. Attraverso questo ruolo, sostiene la proteostasi del RE, modula la segnalazione della risposta alle proteine mal ripiegate (unfolded protein response, UPR) e influenza la stabilità di numerosi substrati coinvolti nella differenziazione e nell’adattamento allo stress. L’attività di SEL1L si interseca con vie che regolano il controllo qualità del RE, i complessi di ubiquitina ligasi e l’omeostasi della via secretoria, processi spesso alterati in condizioni caratterizzate da stress cronico del RE. La capacità ERAD deregolata e l’espressione alterata di SEL1L sono state investigate in studi su neurodegenerazione, disfunzioni metaboliche e biologia tumorale come possibili meccanismi che collegano lo stress proteotossico alle decisioni sul destino cellulare.

Sel-1L Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SEL1L senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Sel-1L Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SEL1L nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SEL1L, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Sel-1L. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SEL1L nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Sel-1L nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Sel-1L nelle cellule tumorali con espressione di SEL1L silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.