SCAP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401474-ACT

La SCAP umana (chaperone di SREBF) è una proteina di membrana del reticolo endoplasmatico che funge da sensore degli steroli e da fattore di accompagnamento per i fattori di trascrizione SREBP, consentendo un traffico regolato verso l’apparato di Golgi per l’attivazione proteolitica. Attraverso questo asse SCAP–SREBP, SCAP controlla programmi trascrizionali che governano la biosintesi di colesterolo e acidi grassi, l’omeostasi dei lipidi di membrana e le risposte adattative alla disponibilità di nutrienti e steroli. L’attività di SCAP si integra con la ritenzione mediata da INSIG, il trasporto dal RE al Golgi e la regolazione a feedback dell’espressione dei geni lipogenici. La deregolazione della segnalazione dipendente da SCAP è stata associata ad alterazioni del metabolismo lipidico osservate nelle malattie metaboliche e a una riprogrammazione lipidica che sostiene la crescita e l’adattamento allo stress in molteplici contesti oncologici.

SCAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SCAP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SCAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SCAP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SCAP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SCAP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SCAP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SCAP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SCAP nelle cellule tumorali con espressione di SCAP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.