SC Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402459-ACT

Il recettore delle immunoglobuline polimeriche (PIGR) codifica la componente secretoria (SC), un recettore transmembrana che lega IgA dimeriche e IgM pentameriche sulla superficie basolaterale delle cellule epiteliali e le trasporta attraverso l’epitelio per la secrezione mucosale. Durante la transcitosi, la SC viene rilasciata per via proteolitica e rimane associata alla IgA secretoria, potenziando l’esclusione immunitaria e proteggendo gli anticorpi dalla proteolisi negli ambienti mucosali. L’espressione di PIGR è regolata da segnali infiammatori e mediati da citochine, incluse le vie NF-κB e JAK/STAT, collegando le risposte innate dell’epitelio all’immunità adattativa delle mucose. Una biologia PIGR/SC disregolata è oggetto di studio nelle disfunzioni di barriera e nell’infiammazione cronica, con implicazioni per la suscettibilità alle infezioni e per le interazioni con il microambiente tumorale epiteliale.

SC Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PIGR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SC Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PIGR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PIGR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SC. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PIGR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SC nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SC nelle cellule tumorali con espressione di PIGR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.