RPA 32 kDa subunit Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401249-ACT

RPA2 codifica la subunità da 32 kDa della proteina A della replicazione (RPA), un complesso eterotrimerico essenziale che si lega al DNA a singolo filamento e stabilizza gli intermedi a ssDNA durante la replicazione, la ricombinazione e la riparazione del DNA. Coordinando l’attivazione dei checkpoint e il reclutamento di nucleasi, elicasi e polimerasi di riparazione, RPA2 sostiene la segnalazione dello stress replicativo dipendente da ATR e preserva l’integrità della forcella replicativa durante la fase S. La funzione di RPA2 è strettamente collegata a vie di mantenimento del genoma, tra cui la riparazione per escissione di nucleotidi, la ricombinazione omologa e le reti di risposta al danno al DNA che prevengono l’accumulo di mutazioni. La deregolazione dell’attività del complesso RPA e della tolleranza allo stress replicativo è stata associata a fenotipi di instabilità genomica rilevanti per la biologia del cancro e per altri disturbi della riparazione del DNA.

RPA 32 kDa subunit Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RPA2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RPA 32 kDa subunit Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RPA2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RPA2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RPA 32 kDa subunit. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RPA2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RPA 32 kDa subunit nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RPA 32 kDa subunit nelle cellule tumorali con espressione di RPA2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.