RNF181 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403952-ACT

RNF181 codifica una ligasi E3 dell’ubiquitina con dominio RING finger che promuove l’ubiquitinazione dei substrati per regolare il turnover proteico e l’output dei segnali. Attraverso la modulazione, dipendente dall’ubiquitina, di intermedi chiave delle vie di segnalazione, RNF181 è implicata nel controllo delle risposte immunitarie e infiammatorie, nell’adattamento allo stress cellulare e nel mantenimento dell’omeostasi proteica. Alterazioni dell’espressione o dell’attività di RNF181 possono perturbare ampiezza e tempistica delle vie di segnalazione, collegandone la regolazione a meccanismi rilevanti per la segnalazione oncogenica, la disfunzione immunitaria e altre condizioni in cui la segnalazione mediata dall’ubiquitina è deregolata. Queste caratteristiche rendono RNF181 un nodo utile per analizzare il controllo delle vie mediato dall’ubiquitina e i cambiamenti dello stato trascrizionale in modelli cellulari umani.

RNF181 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RNF181 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RNF181 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RNF181 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RNF181, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RNF181. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RNF181 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RNF181 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RNF181 nelle cellule tumorali con espressione di RNF181 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.