RICK Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400731-ACT

La chinasi proteica citosolica serina/treonina 2 interagente con il recettore (Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 2, RIPK2; nota anche come RICK) è una chinasi di segnalazione citosolica che funge da adattatore chiave a valle dei recettori di riconoscimento dei pattern NOD1 e NOD2. In seguito al riconoscimento di motivi del peptidoglicano batterico, RIPK2 media una segnalazione ubiquitina-dipendente che attiva le vie NF-κB e MAPK, modulando l’espressione dei geni infiammatori, la produzione di citochine e il dialogo dell’immunità innata con cellule epiteliali e mieloidi. RIPK2 interagisce inoltre con l’autofagia e con la segnalazione legata allo stress cellulare attraverso la regolazione di ligasi dell’ubiquitina e di cascate chinasiche a valle. Un’attività deregolata della via di RIPK2 è stata associata a fenotipi infiammatori cronici e a patologie immuno-mediate, rendendola un nodo ampiamente studiato nella ricerca sulle interazioni ospite–microbo e sulla segnalazione infiammatoria.

RICK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RIPK2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RICK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RIPK2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RIPK2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RICK. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RIPK2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RICK nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RICK nelle cellule tumorali con espressione di RIPK2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.