Rfp2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403870-ACT

TRIM13 (Rfp2) è una ligasi E3 dell’ubiquitina con dominio RING finger umana, arricchita a livello del reticolo endoplasmatico, dove regola l’omeostasi proteica catalizzando l’ubiquitinazione e indirizzando i substrati verso la degradazione proteasomiale. Partecipa alla degradazione associata al RE (ERAD) e a un controllo più ampio del sistema ubiquitina–proteasoma, influenzando le risposte cellulari alle proteine mal ripiegate, allo stress ossidativo e all’apoptosi. Attraverso la modulazione di componenti di segnalazione e delle vie di controllo qualità, Rfp2 può incidere su programmi infiammatori e di sopravvivenza che orientano le decisioni sul destino cellulare. Un’alterazione dell’espressione o dell’attività di TRIM13 è stata riportata in studi sulla biologia del cancro e sugli squilibri della proteostasi associati alla neurodegenerazione, a supporto della sua rilevanza come nodo di connessione tra stress del RE e segnalazione mediata dall’ubiquitina.

Rfp2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TRIM13 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rfp2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TRIM13 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TRIM13, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rfp2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TRIM13 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rfp2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rfp2 nelle cellule tumorali con espressione di TRIM13 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.