RASL11A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-409106-ACT

RASL11A codifica una piccola GTPasi simile a Ras implicata nella regolazione delle reti di trasduzione del segnale che collegano il legame e l’idrolisi del GTP al controllo a valle della crescita cellulare, della differenziazione e dell’organizzazione del citoscheletro. Come parte della più ampia superfamiglia Ras, RASL11A è in una posizione tale da influenzare vie correlate a MAPK e altri percorsi dipendenti da GTPasi che coordinano il traffico di membrana e l’omeostasi cellulare. Un’alterata regolazione della segnalazione della famiglia Ras è ampiamente associata alla trasformazione oncogenica e a fenotipi di risposta allo stress, rendendo l’espressione e l’attività di RASL11A rilevanti per studiare la modulazione fine delle vie di segnalazione nella biologia del cancro. Le sue dinamiche di espressione endogena supportano inoltre studi su programmi di segnalazione specifici di tessuto e su risposte dipendenti dal contesto a diverse perturbazioni.

RASL11A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RASL11A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RASL11A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RASL11A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RASL11A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RASL11A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RASL11A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RASL11A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RASL11A nelle cellule tumorali con espressione di RASL11A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.