RASAL3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404999-ACT

RASAL3 (RAS protein activator like 3) codifica una proteina attivatrice della GTPasi Ras che favorisce la conversione di Ras-GTP attivo in Ras-GDP inattivo, limitando così ampiezza e durata della segnalazione dipendente da Ras. Attraverso la regolazione negativa delle vie Ras/MAPK e di altre vie correlate delle piccole GTPasi, RASAL3 contribuisce al controllo degli stati di attivazione cellulare, dei segnali proliferativi e dei programmi trascrizionali a valle. La sua attività è particolarmente rilevante nei contesti di segnalazione delle cellule immunitarie, in cui la messa a punto della via di Ras influenza le risposte guidate dai recettori e la differenziazione cellulare. Un controllo disfunzionale della via di Ras è implicato in numerosi processi infiammatori e oncogenici, rendendo RASAL3 un nodo utile per studi meccanicistici dell’omeostasi della segnalazione.

RASAL3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RASAL3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RASAL3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RASAL3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RASAL3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RASAL3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RASAL3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RASAL3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RASAL3 nelle cellule tumorali con espressione di RASAL3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.