Rad50 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401617-ACT

RAD50 umano codifica Rad50, un componente centrale del complesso MRN (MRE11-RAD50-NBN) che rileva le rotture a doppio filamento del DNA e coordina la segnalazione della risposta al danno al DNA. Le attività ATPasica e di “tethering” di Rad50 contribuiscono a collegare tra loro le estremità di DNA rotte e a supportare la ricombinazione omologa, il non-homologous end joining (NHEJ), la stabilità delle forche di replicazione e il mantenimento dei telomeri. Attraverso l’accoppiamento funzionale con l’attivazione del checkpoint dipendente da ATM e con il controllo della resezione delle estremità, RAD50 influenza l’arresto del ciclo cellulare e i programmi di sorveglianza del genoma. La disregolazione dell’attività del complesso MRN e i difetti di riparazione del DNA associati a RAD50 sono collegati a fenotipi di instabilità genomica frequentemente studiati in biologia del cancro e nei disordini ereditari della riparazione del DNA.

Rad50 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAD50 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rad50 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAD50 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAD50, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rad50. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAD50 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rad50 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rad50 nelle cellule tumorali con espressione di RAD50 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.