Rad21 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422577-ACT

Il RAD21 murino è un componente centrale del complesso cohesina, che stabilizza la coesione tra cromatidi fratelli e coordina la segregazione dei cromosomi durante mitosi e meiosi. Oltre al suo ruolo strutturale, RAD21 contribuisce alla riparazione dei danni al DNA, alla stabilità delle forcelle di replicazione e all’organizzazione tridimensionale del genoma, modulando la dinamica dei loop di cromatina e le interazioni a lunga distanza tra enhancer e promotori. Attraverso queste funzioni, Rad21 aiuta a regolare i programmi trascrizionali che controllano proliferazione e differenziamento, collegando l’attività della cohesina al patterning dello sviluppo e all’omeostasi tissutale. Una funzione della cohesina deregolata, inclusi livelli alterati di RAD21, è stata associata a instabilità genomica e a profili di espressione genica aberranti rilevanti per la biologia dei tumori e per sindromi dello sviluppo correlate alla cohesina.

Rad21 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Rad21 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rad21 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Rad21 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Rad21, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rad21. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Rad21 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rad21 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rad21 nelle cellule tumorali con espressione di Rad21 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.