Rac 3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403445-ACT

RAC3 codifica Rac 3, un membro della famiglia Rho delle piccole GTPasi che alterna stati legati a GDP e a GTP per coordinare il rimodellamento del citoscheletro di actina e le dinamiche di membrana. Rac 3 partecipa a reti di segnalazione che regolano la migrazione e l’adesione cellulare, la crescita dei neuriti e il traffico vescicolare tramite effettori a valle che includono le chinasi PAK, il complesso WAVE/Arp2/3 e vie correlate a PI3K. Nelle cellule umane, un’alterata attività di RAC3 è stata associata a una regolazione disfunzionale del citoscheletro e a programmi trascrizionali che influenzano la proliferazione e fenotipi invasivi in diversi contesti rilevanti per la malattia. Queste proprietà rendono RAC3 un nodo utile per studiare il crosstalk tra la segnalazione delle Rho GTPasi, gli input mediati dai recettori e i comportamenti cellulari dipendenti dal citoscheletro.

Rac 3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAC3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rac 3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAC3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAC3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rac 3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAC3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rac 3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rac 3 nelle cellule tumorali con espressione di RAC3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.