Rab 7 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400465-ACT

RAB7A codifica Rab7, una piccola GTPasi che regola la maturazione degli endosomi tardivi, il traffico endosoma–lisosoma e la biogenesi dei lisosomi. Coordinando gli eventi di motilità, ancoraggio e fusione delle vescicole, Rab7 favorisce la degradazione del carico, la downregulation dei recettori e la fusione tra autofagosomi e lisosomi all’interno del sistema endolisosomiale. Questa via interseca i meccanismi di sensing dei nutrienti e le risposte allo stress cellulare, influenzando il controllo di qualità mitocondriale e la proteostasi. Un’attività deregolata di RAB7A è stata associata a fenotipi neurodegenerativi e neuropatici, ad alterazioni dell’ingresso/replicazione di patogeni e a cambiamenti legati al cancro nel traffico intracellulare e negli output di segnalazione.

Rab 7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAB7A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rab 7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAB7A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAB7A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rab 7. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAB7A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rab 7 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rab 7 nelle cellule tumorali con espressione di RAB7A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.