Rab 44 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-418677-ACT

RAB44 codifica Rab 44, una piccola GTPasi della famiglia Rab di grandi dimensioni implicata nel traffico vescicolare e nelle dinamiche di membrana che coordinano il trasporto intracellulare, l’organizzazione endolisosomiale e la secrezione regolata. Come interruttore molecolare che cicla tra stati legati a GTP e a GDP, ci si aspetta che Rab 44 interagisca con i macchinari Rab-dipendenti di tethering e fusione che modellano la maturazione dei compartimenti e gli output di segnalazione. Alterazioni dei pattern di espressione di RAB44 sono state riportate in contesti legati al sistema immunitario e nei trascrittomi tumorali, a supporto del suo impiego come marcatore e nodo funzionale per studiare programmi di traffico deregolati in stati cellulari associati alla malattia. Indagare l’attività di Rab 44 può aiutare a definire come il trasporto vescicolare influenzi il riciclo dei recettori, la segnalazione infiammatoria e le risposte allo stress cellulare.

Rab 44 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAB44 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rab 44 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAB44 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAB44, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rab 44. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAB44 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rab 44 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rab 44 nelle cellule tumorali con espressione di RAB44 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.