PYK2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422493-ACT

Mouse Ptk2b codifica PYK2, una tirosin-chinasi non recettoriale attivata dai flussi di Ca²⁺ e dall’ingaggio delle integrine, che coordina la segnalazione nelle adesioni focali e alle interfacce del citoscheletro. PYK2 integra segnali provenienti da GPCR, recettori per fattori di crescita e recettori immunitari per modulare adesione, migrazione e sopravvivenza cellulare, e si interseca con vie che includono le chinasi della famiglia Src, MAPK/ERK, PI3K-AKT e la segnalazione delle GTPasi Rho. In contesti ematopoietici e mieloidi, Ptk2b influenza la segnalazione infiammatoria e la motilità dei fagociti, mentre nelle cellule neurali contribuisce a programmi di segnalazione sinaptici e dipendenti dall’attività. Un’attività di PYK2 deregolata e le associazioni genetiche di PTK2B sono state collegate in letteratura a processi immunomediati e rilevanti per la neurodegenerazione, a supporto di studi meccanicistici delle reti di segnalazione e dei fenotipi cellulari.

PYK2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ptk2b senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PYK2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ptk2b nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ptk2b, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PYK2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ptk2b nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PYK2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PYK2 nelle cellule tumorali con espressione di Ptk2b silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.