PRP8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402819-ACT

PRPF8 codifica PRP8, un componente centrale altamente conservato della piccola ribonucleoproteina nucleare U5 (snRNP) all’interno dello spliceosoma di tipo U2, dove contribuisce a coordinare la formazione del centro catalitico e la ligazione degli esoni durante lo splicing del pre‑mRNA. Grazie alle sue estese interazioni con RNA e proteine dello spliceosoma, PRP8 supporta il riconoscimento dei siti di splicing, la dinamica di assemblaggio dello spliceosoma e l’integrità del trascrittoma in diversi programmi genici. L’alterazione della funzione di PRPF8 può perturbare i pattern di splicing alternativo, causando cambiamenti diffusi nell’elaborazione dell’RNA e nelle vie a valle collegate al controllo del ciclo cellulare, alle risposte al danno al DNA e alla proteostasi. Un’attività anomala dello spliceosoma che coinvolge PRPF8 è stata associata a patologie retiniche ereditarie ed è stata studiata nel contesto della disregolazione dello spliceosoma osservata nelle neoplasie e in altre malattie caratterizzate da un’elaborazione dell’RNA alterata.

PRP8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PRPF8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PRP8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PRPF8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PRPF8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PRP8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PRPF8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PRP8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PRP8 nelle cellule tumorali con espressione di PRPF8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.