PR3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402550-ACT

PRTN3 codifica la proteinasi 3 (PR3), una serin-proteasi dei neutrofili immagazzinata nei granuli azurofili e mobilizzata verso i fagosomi e la superficie cellulare durante l’attivazione dell’immunità innata. PR3 contribuisce alla difesa antimicrobica e alla segnalazione infiammatoria attraverso il processamento proteolitico di componenti della matrice extracellulare, citochine e reti di chemochine, interfacciandosi con le vie della degranulazione, della formazione di NET e del traffico leucocitario. Un’attività di PR3 deregolata e un riconoscimento immunitario aberrante sono associati a danno tissutale infiammatorio e rappresentano importanti indicatori meccanicistici negli studi sulla patologia guidata dai neutrofili, inclusi i processi vasculitici autoimmuni. Le dinamiche di espressione di PRTN3 sono quindi spesso analizzate in modelli di differenziazione mieloide, saggi di segnalazione infiammatoria e nella mappatura delle vie proteasi-substrato.

PR3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PRTN3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PR3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PRTN3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PRTN3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PR3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PRTN3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PR3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PR3 nelle cellule tumorali con espressione di PRTN3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.