PNK Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404266-ACT

Il gene umano **PNKP** codifica la **polinucleotide chinasi 3′-fosfatasi** (PNK), un enzima bifunzionale di processamento delle estremità del DNA che ripristina i terminali **5′-fosfato** e **3′-idrossile** necessari per la ligazione durante la riparazione delle rotture a singolo filamento del DNA. PNK agisce a valle di **PARP1** e **XRCC1** e si interfaccia con la riparazione per escissione di basi e con il **non-homologous end joining** preparando le estremità danneggiate del DNA generate da specie reattive dell’ossigeno, radiazioni ionizzanti e reazioni abortive delle topoisomerasi. Attraverso queste vie, PNKP contribuisce a preservare la stabilità del genoma e supporta la normale replicazione e trascrizione in cellule proliferanti e post-mitotiche. L’alterazione del processamento delle estremità mediato da PNKP è associata a una maggiore sensibilità allo stress genotossico ed è stata collegata a fenotipi di neurosviluppo e neurodegenerativi derivanti da una capacità di riparazione del DNA difettosa.

PNK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PNKP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PNK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PNKP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PNKP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PNK. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PNKP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PNK nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PNK nelle cellule tumorali con espressione di PNKP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.