PML Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400145-ACT

Il gene PML umano codifica la proteina della leucemia promielocitica, un organizzatore chiave dei corpi nucleari PML che coordinano la regolazione trascrizionale, le risposte al danno al DNA, l’apoptosi e la difesa antivirale intrinseca. PML influenza le reti di SUMOilazione post-traduzionale e interagisce con vie di segnalazione che includono il pathway di p53, i programmi genici stimolati dall’interferone e il rimodellamento della cromatina, contribuendo a determinare le decisioni sul destino cellulare in condizioni di stress. La compromissione o un’alterata regolazione della dinamica dei corpi nucleari PML è stata associata alla trasformazione oncogena e a difetti nella sorveglianza del genoma, con particolare rilevanza nella biologia delle neoplasie ematologiche e in modelli più ampi di cancro. In quanto proteina scaffold con effetti dipendenti dal contesto, PML rappresenta un nodo accessibile per analizzare la compartimentalizzazione nucleare e i circuiti di risposta allo stress nelle cellule umane.

PML Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PML senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PML Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PML nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PML, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PML. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PML nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PML nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PML nelle cellule tumorali con espressione di PML silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.