PLIC-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404783-ACT

UBQLN2 umano codifica la proteina ubiquitin-like PLIC-2, un recettore e adattatore dell’ubiquitina che collega i substrati poliubiquitinati al proteasoma 26S per mantenere la proteostasi. PLIC-2 partecipa al controllo qualità delle proteine dipendente dall’ubiquitina, alla degradazione associata al RE (ERAD) e al turnover di proteine mal ripiegate o inclini all’aggregazione, collegandola alle risposte allo stress cellulare e al crosstalk tra autofagia e proteasoma. Una funzione disregolata di UBQLN2 è stata associata ad aggregazione proteica aberrante e a vie di eliminazione compromesse, rilevanti per i meccanismi delle malattie neurodegenerative, incluse la SLA e le patologie dello spettro della demenza frontotemporale. In quanto nodo della segnalazione ubiquitina–proteasoma, UBQLN2 è spesso studiato per i suoi ruoli nell’omeostasi neuronale, nella formazione di inclusioni citoplasmatiche e nella modulazione delle vie di stress proteotossico.

PLIC-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UBQLN2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PLIC-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UBQLN2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UBQLN2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PLIC-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UBQLN2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PLIC-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PLIC-2 nelle cellule tumorali con espressione di UBQLN2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.