PI 3-kinase p110δ Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422232-ACT

Pik3cd codifica la subunità catalitica p110δ della fosfoinositide 3-chinasi (PI3K) di classe I, un enzima chiave che converte PIP2 in PIP3 per avviare a valle la segnalazione AKT/mTOR. La PI3K p110δ è arricchita nelle linee ematopoietiche e sostiene la segnalazione dei recettori dell’antigene, la migrazione guidata dalle chemochine e i programmi di sopravvivenza mediati dalle citochine che modellano l’attivazione e la differenziazione delle cellule immunitarie. Un’alterazione dell’attività di Pik3cd può perturbare l’omeostasi immunitaria e la segnalazione infiammatoria, rendendolo un nodo ampiamente utilizzato per analizzare la trasduzione del segnale nei leucociti. Nei modelli murini, la modulazione di p110δ rappresenta un punto d’ingresso gestibile per studiare il crosstalk della via con MAPK, NF-κB e il controllo metabolico della funzione immunitaria.

PI 3-kinase p110δ Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Pik3cd senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PI 3-kinase p110δ Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Pik3cd nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Pik3cd, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PI 3-kinase p110δ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Pik3cd nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PI 3-kinase p110δ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PI 3-kinase p110δ nelle cellule tumorali con espressione di Pik3cd silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.