PDH-E1α Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401044-ACT

PDHA1 codifica la subunità E1 alfa del complesso della piruvato deidrogenasi (PDH), un assemblaggio multienzimatico mitocondriale che catalizza la decarbossilazione ossidativa del piruvato ad acetil-CoA, collegando la glicolisi al ciclo dell’acido tricarbossilico e alla fosforilazione ossidativa. La funzione di PDH-E1α è strettamente regolata da un controllo dipendente dalla fosforilazione dell’attività di PDH, coordinando il flusso del carbonio, l’equilibrio redox e la produzione di ATP in risposta alla disponibilità di nutrienti. Un’alterata espressione di PDHA1 o la disfunzione del complesso PDH sono associate a una riprogrammazione metabolica, a una respirazione mitocondriale compromessa e a fenotipi di acidosi lattica, con rilevanza per la ricerca sulle patologie neurometaboliche e mitocondriali. In quanto nodo centrale del metabolismo del carbonio, PDHA1 è frequentemente studiato in modelli di stress ossidativo, risposta all’ipossia e adattamento bioenergetico.

PDH-E1α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PDHA1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PDH-E1α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PDHA1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PDHA1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PDH-E1α. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PDHA1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PDH-E1α nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PDH-E1α nelle cellule tumorali con espressione di PDHA1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.