PCLAF Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402724-ACT

PCLAF (PCNA clamp associated factor, noto anche come KIAA0101) è una proteina che si lega a PCNA e coordina la replicazione e la riparazione del DNA modulando la sintesi processiva del DNA e il reclutamento di fattori di riparazione alle forcelle di replicazione bloccate. Partecipa alla progressione del ciclo cellulare, in particolare alla fase S, e influenza la stabilità del genoma attraverso vie legate alle risposte allo stress replicativo e alla tolleranza del danno al DNA post-replicativo. Un’alterata espressione di PCLAF è stata associata a fenotipi proliferativi e a un controllo dei checkpoint deregolato in diversi contesti correlati al cancro, rendendola un nodo utile per lo studio delle dinamiche della cromatina accoppiate alla replicazione. I ricercatori studiano comunemente PCLAF per collegare la segnalazione dipendente da PCNA, le reti di risposta al danno al DNA e i programmi trascrizionali che supportano una rapida divisione cellulare.

PCLAF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PCLAF senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PCLAF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PCLAF nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PCLAF, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PCLAF. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PCLAF nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PCLAF nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PCLAF nelle cellule tumorali con espressione di PCLAF silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.