Plásmido CRISPR de Activación (h) parvalbumin α: sc-401364-ACT

PVALB codifica la parvalbúmina alfa, una proteína de unión a calcio de alta afinidad con motivo EF-hand que modula la dinámica intracelular de Ca²⁺ al acelerar el amortiguamiento (buffering) y la relajación del Ca²⁺ en células excitables. En el sistema nervioso, la parvalbúmina es un marcador de interneuronas GABAérgicas de disparo rápido y favorece una temporización precisa de los potenciales de acción y las oscilaciones de red al influir en la liberación de neurotransmisores dependiente de Ca²⁺ y en la integración sináptica. Más allá de los circuitos neuronales, el amortiguamiento de calcio por la parvalbúmina contribuye a la cinética de contracción–relajación en el músculo y a otros procesos celulares regulados por Ca²⁺. Las alteraciones en la expresión de PVALB y en la función de las interneuronas positivas para parvalbúmina se han asociado con fenotipos del neurodesarrollo y neuropsiquiátricos, lo que hace que la regulación de PVALB sea relevante para estudios de excitabilidad de circuitos y señalización dependiente de calcio.

parvalbumin α El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PVALB sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

parvalbumin α El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PVALB en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PVALB, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de parvalbumin α. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PVALB y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de parvalbumin α en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía parvalbumin α en células tumorales con expresión de PVALB silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.