PARP-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402224-ACT

Il gene umano PARP2 codifica la poli(ADP-ribosio) polimerasi-2 (PARP-2), un enzima nucleare che rileva le rotture dei filamenti di DNA e catalizza l’ADP-ribosilazione di proteine bersaglio per coordinare il rimodellamento della cromatina e la riparazione del DNA. PARP-2 opera nella risposta al danno al DNA, in particolare nella riparazione per escissione di basi e nella riparazione associata alla replicazione, e coopera con PARP1 e XRCC1 nell’organizzare l’assemblaggio dei complessi di riparazione. Attraverso la regolazione della stabilità del genoma, dell’integrità delle forcelle di replicazione e della segnalazione dei checkpoint del ciclo cellulare, PARP2 contribuisce alle risposte cellulari allo stress, spesso alterate nella biologia tumorale e nei difetti di riparazione del DNA associati alla neurodegenerazione. La modulazione dell’espressione di PARP2 è quindi utile per analizzare le vie di risposta allo stress genotossico, le risposte trascrizionali al danno al DNA e la sensibilità dipendente dal contesto alle perturbazioni della riparazione del DNA in modelli cellulari umani.

PARP-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PARP2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PARP-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PARP2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PARP2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PARP-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PARP2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PARP-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PARP-2 nelle cellule tumorali con espressione di PARP2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.