Orexin R-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402343-ACT

HCRTR2 codifica il recettore dell’orexina 2 (Orexin R-2), un recettore accoppiato a proteine G per i neuropeptidi orexina-A e orexina-B che integra i segnali di arousal ipotalamici con le risposte autonomiche e neuroendocrine. In seguito al legame con il ligando, Orexin R-2 si accoppia principalmente alle vie di segnalazione Gq/11 e Gi/o per modulare la mobilizzazione del Ca²⁺ intracellulare, l’attività MAPK/ERK e l’eccitabilità neuronale, influenzando così la regolazione sonno–veglia, l’omeostasi energetica e le risposte allo stress. L’attività di HCRTR2 viene studiata in vie che regolano la biologia circadiana, la trasmissione sinaptica e il rimodellamento dei circuiti associato alla neuroinfiammazione. Alterazioni genetiche e funzionali della segnalazione dell’orexina sono state associate a disturbi del sonno come la narcolessia e fenotipi correlati di ipersonnolenza, e sono anche investigate nel contesto della disregolazione metabolica e di tratti neuropsichiatrici.

Orexin R-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HCRTR2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Orexin R-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HCRTR2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HCRTR2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Orexin R-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HCRTR2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Orexin R-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Orexin R-2 nelle cellule tumorali con espressione di HCRTR2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.