Orexin-A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400357-ACT

L’HCRT umano codifica la prepro-orexina, che viene processata proteoliticamente per generare l’orexina-A, un neuropeptide che segnala principalmente attraverso OX1R e OX2R (HCRTR1/HCRTR2) per regolare l’arousal, la stabilità sonno–veglia, il comportamento alimentare, l’elaborazione della ricompensa e l’omeostasi autonoma. L’orexina-A attiva vie mediate da GPCR, incluse la segnalazione accoppiata a Gq/11 e Gi/o, modulando la dinamica del calcio intracellulare, l’attività MAPK/ERK e l’eccitabilità neuronale nei circuiti ipotalamici e del tronco encefalico. La disregolazione della segnalazione dell’orexina è fortemente associata a disturbi del sonno come la narcolessia e a fenotipi più ampi che coinvolgono l’equilibrio metabolico e la risposta allo stress. Nella ricerca biomedica, HCRT/orexina-A viene utilizzata per studiare la funzione delle reti neuromodulatorie, l’integrazione a livello di circuito dello stato energetico e i programmi trascrizionali associati ad arousal e motivazione.

Orexin-A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HCRT senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Orexin-A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HCRT nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HCRT, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Orexin-A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HCRT nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Orexin-A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Orexin-A nelle cellule tumorali con espressione di HCRT silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.