OPN1LW Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-417309-ACT

OPN1LW codifica l’opsina sensibile alle lunghezze d’onda lunghe (opsina dei coni L), un fotopigmento di tipo GPCR espresso nei fotorecettori conici della retina che avvia la fototrasduzione in risposta alla luce rossa. Dopo l’assorbimento del fotone e l’isomerizzazione dell’11-cis-retinale, OPN1LW attiva la cascata transducina–PDE6 riducendo i livelli di cGMP, chiudendo i canali regolati da nucleotidi ciclici e modulando il potenziale di membrana e la trasmissione sinaptica nella via visiva. La sua espressione è strettamente regolata da programmi trascrizionali specifici dei coni e dal contesto della cromatina all’interno del cluster genico delle opsine su Xq28, contribuendo alla regolazione spettrale fine e all’identità dei sottotipi di cono. Varianti ed espressione disregolata di OPN1LW sono associate a deficit ereditari della visione dei colori e a disfunzione dei fotorecettori conici, offrendo un punto d’accesso molecolare per studiare le relazioni genotipo–fenotipo nella biologia della visione umana.

OPN1LW Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di OPN1LW senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

OPN1LW Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus OPN1LW nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione OPN1LW, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di OPN1LW. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus OPN1LW nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da OPN1LW nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via OPN1LW nelle cellule tumorali con espressione di OPN1LW silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.