NSFL1C p47 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402328-ACT

NSFL1C (p47) codifica una proteina adattatrice che si lega all’ATPasi AAA+ VCP/p97 e ne facilita il reclutamento verso specifici substrati nel controllo di qualità proteico dipendente dall’ubiquitina. NSFL1C p47 è implicata nel traffico di membrana e nella dinamica Golgi/RE, inclusi eventi di rimodellamento mediati dal cofattore di p97 che influenzano la fusione delle vescicole e la riassemblaggio degli organelli. Attraverso il suo ruolo nella proteostasi e in vie di degradazione sensibili allo stress, come la degradazione associata al reticolo endoplasmatico (ERAD), un’alterazione della funzione di p47 può modulare la sensibilità cellulare allo stress proteotossico e il rimodellamento dei compartimenti secretori. La disregolazione dell’asse p97–cofattori è stata collegata a neurodegenerazione e a dipendenze di proteostasi associate al cancro, rendendo NSFL1C un nodo utile per studi meccanicistici di questi processi.

NSFL1C p47 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NSFL1C senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NSFL1C p47 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NSFL1C nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NSFL1C, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NSFL1C p47. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NSFL1C nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NSFL1C p47 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NSFL1C p47 nelle cellule tumorali con espressione di NSFL1C silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.