NRSF Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-418578-ACT

Il fattore di trascrizione silenziatore RE1 (REST), noto anche come neuron-restrictive silencer factor (NRSF), è un repressore trascrizionale a dita di zinco che si lega agli elementi RE1/NRSE per regolare ampie reti geniche che controllano la differenziazione neuronale, la funzione sinaptica e la trascrizione dipendente dall’attività. Reclutando complessi corepressori come CoREST, le HDAC e enzimi che modificano la cromatina, REST modella gli stati epigenetici e modula i programmi di processamento dell’RNA in contesti neurali e non neurali. La regolazione dipendente da REST interseca il rimodellamento della cromatina, l’espressione dei canali ionici e le vie di risposta allo stress che influenzano le decisioni sul destino cellulare e l’eccitabilità. Un’attività REST/NRSF deregolata è stata implicata in fenotipi neuroevolutivi e neurodegenerativi, nonché nella biologia dei tumori, sostenendone l’uso come nodo meccanicistico per lo studio della repressione trascrizionale e dei circuiti genici neuronali nelle cellule umane.

NRSF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di REST senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NRSF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus REST nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione REST, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NRSF. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus REST nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NRSF nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NRSF nelle cellule tumorali con espressione di REST silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.