Nrl Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402610-ACT

NRL (neural retina leucine zipper) codifica il fattore di trascrizione Nrl, un regolatore basic leucine zipper che svolge un ruolo centrale nello sviluppo dei fotorecettori e nella definizione dell’identità delle cellule a bastoncello. Legandosi a elementi cis‑regolatori e coordinando reti trascrizionali con altri fattori retinici, Nrl controlla programmi coinvolti nella fototrasduzione, nella formazione del segmento esterno e nell’omeostasi metabolica dei neuroni differenziati. La disregolazione dell’espressione genica associata a NRL è collegata a patologie retiniche ereditarie e a una compromissione della funzione dei fotorecettori, rendendo NRL un nodo utile per lo studio dei circuiti di regolazione genica nella biologia della retina. L’attività di Nrl nell’uomo è quindi rilevante per le ricerche sulla differenziazione neuronale, la specificazione del destino cellulare e il controllo trascrizionale nella retina.

Nrl Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NRL senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Nrl Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NRL nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NRL, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Nrl. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NRL nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Nrl nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Nrl nelle cellule tumorali con espressione di NRL silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.