NEDD8 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-417924-LAC

NEDD8 codifica la proteina 8 espressa nelle cellule precursori neurali e regolata negativamente durante lo sviluppo (neural precursor cell expressed developmentally downregulated protein 8), un modificatore ubiquitina-simile che viene coniugato ai bersagli attraverso la cascata di neddilazione (E1 NAE1/UBA3, E2 UBE2M/UBE2F ed enzimi E3 ligasi). La coniugazione di NEDD8 è un regolatore centrale delle ligasi ubiquitina cullin-RING, promuovendo il turnover ubiquitina-dipendente di proteine che controllano la progressione del ciclo cellulare, la replicazione del DNA, le risposte allo stress e la trasduzione del segnale. Modulando la proteostasi e il controllo dei checkpoint, NEDD8 influenza vie legate alla stabilità del genoma e alla segnalazione infiammatoria. La neddilazione deregolata è stata associata a programmi proliferativi alterati e a reti aberranti di degradazione proteica osservate in molteplici stati cellulari rilevanti per la malattia.

Le particelle di attivazione lentivirale NEDD8 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di NEDD8 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale NEDD8 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione NEDD8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di NEDD8. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo NEDD8 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.