NEDD4 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-421848-LAC

Mouse Nedd4 codifica NEDD4, una ligasi E3 dell’ubiquitina con dominio HECT che regola il turnover proteico e la segnalazione catalizzando il trasferimento di ubiquitina a recettori di membrana, canali ionici e intermedi della segnalazione. Tramite il riconoscimento, mediato dai domini WW, di substrati con motivo PY, NEDD4 influenza l’endocitosi e il trafficking delle proteine di superficie e modula vie quali PI3K–AKT, TGF-β e la segnalazione associata a EGFR, con effetti a valle su crescita, sopravvivenza e migrazione cellulari. L’attività di NEDD4 interseca inoltre le reti di proteostasi e di risposta allo stress, plasmando il rimodellamento ubiquitina-dipendente dei complessi di segnalazione cellulari. Una ubiquitinazione NEDD4-dipendente deregolata è stata implicata in fenotipi rilevanti per la patologia, tra cui alterazioni del trasporto epiteliale, segnalazione proliferativa aberrante e disfunzioni immunitarie e neuronali, rendendola un nodo utile per studi meccanicistici.

Le particelle di attivazione lentivirale NEDD4 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Nedd4 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale NEDD4 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Nedd4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di NEDD4. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Nedd4 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.