NEDD4-L Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403647-ACT

NEDD4L codifica NEDD4-L, una ligasi E3 dell’ubiquitina di tipo HECT che regola il turnover proteico catalizzando il trasferimento di ubiquitina su specifici substrati di membrana e citosolici. È nota soprattutto per il controllo dell’abbondanza e del traffico sulla superficie del canale epiteliale del sodio (ENaC), collegando l’attività di NEDD4-L al trasporto ionico, all’omeostasi dei fluidi e alle risposte cellulari allo stress. NEDD4-L interagisce inoltre con vie di segnalazione tra cui TGF-β/SMAD e Wnt/β-catenina attraverso la modulazione ubiquitina-dipendente dei componenti di questi pathway, influenzando la differenziazione cellulare e il rimodellamento tissutale. Alterazioni dell’espressione o della funzione di NEDD4L sono state associate a una gestione del sodio disregolata e a programmi di segnalazione aberranti implicati nella biologia delle malattie cardiometaboliche e fibrotiche.

NEDD4-L Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NEDD4L senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NEDD4-L Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NEDD4L nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NEDD4L, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NEDD4-L. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NEDD4L nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NEDD4-L nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NEDD4-L nelle cellule tumorali con espressione di NEDD4L silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.