MYH13 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400602-ACT

MYH13 codifica la catena pesante della miosina 13, una proteina motrice del muscolo scheletrico a contrazione rapida che alimenta la contrazione dipendente dall’actina attraverso un ciclo dei ponti trasversali guidato dall’attività ATPasica all’interno del sarcomero. Come parte dell’apparato contrattile miofibrillare, MYH13 contribuisce alla specializzazione delle fibre muscolari e regola la generazione di forza e la velocità di accorciamento nel muscolo striato. Un’espressione alterata o una disregolazione dei programmi della miosina sarcomerica è rilevante per studi sullo sviluppo muscolare, sullo switching del tipo di fibra e sui percorsi di rimodellamento che influenzano la fisiologia neuromuscolare. MYH13 rappresenta quindi un utile “appiglio” molecolare per indagare le reti trascrizionali che governano struttura e funzione del muscolo scheletrico, inclusi la differenziazione miogenica e i moduli genici associati alla contrattilità.

MYH13 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MYH13 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MYH13 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MYH13 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MYH13, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MYH13. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MYH13 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MYH13 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MYH13 nelle cellule tumorali con espressione di MYH13 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.