mPRε Plasmide di attivazione CRISPR (m2): sc-429117-ACT-2

Il gene Paqr9 del topo codifica il recettore di membrana del progesterone epsilon (mPRε), un membro della famiglia PAQR implicato nella segnalazione rapida e non genomica del progesterone a livello delle membrane cellulari. Si ritiene che mPRε moduli gli output di segnalazione accoppiati alle proteine G, influenzando vie di secondi messaggeri come il cAMP e la dinamica del calcio, che plasmano proliferazione cellulare, differenziamento e risposte allo stress nei tessuti sensibili agli ormoni. La disregolazione delle reti di segnalazione steroidea associate a Paqr9 è stata collegata ad alterazioni della fisiologia riproduttiva e neuroendocrina ed è oggetto di studio in contesti che includono la biologia dei tumori ormono-dipendenti e l’infiammazione metabolica. Studi di gene editing e di genomica funzionale mirati a Paqr9 supportano l’analisi meccanicistica delle vie responsiva al progesterone, del cross-talk tra recettori e dei programmi di segnalazione specifici per tipo cellulare in modelli murini e in sistemi cellulari ingegnerizzati.

mPRε Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Paqr9 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

mPRε Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Paqr9 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Paqr9, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di mPRε. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Paqr9 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da mPRε nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via mPRε nelle cellule tumorali con espressione di Paqr9 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.