MESP1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404176-ACT

MESP1 (fattore di trascrizione basic helix-loop-helix del mesoderma posteriore 1) è un regolatore maestro della specificazione precoce del mesendoderma e dell’impegno verso la linea cardiovascolare nello sviluppo umano. In quanto fattore di trascrizione bHLH, MESP1 coordina programmi trascrizionali che governano le decisioni di destino cellulare associate alla gastrulazione, la transizione epitelio-mesenchimale e la migrazione dei progenitori, agendo a monte di reti che definiscono il patterning del mesoderma e avviano la cardiogenesi. Un’attività deregolata di MESP1 può perturbare le traiettorie di differenziamento ed è stata implicata in difetti dello sviluppo e in un’alterata plasticità di linea, rilevanti per la biologia delle cardiopatie congenite e per la modellizzazione delle malattie con cellule staminali. In vitro, una modulazione controllata di MESP1 supporta studi meccanicistici sulle reti di regolazione genica dello sviluppo precoce e protocolli di differenziamento per tipi cellulari derivati dal mesoderma.

MESP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MESP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MESP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MESP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MESP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MESP1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MESP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MESP1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MESP1 nelle cellule tumorali con espressione di MESP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.