Mel-CAM Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401020-ACT

MCAM codifica Mel-CAM (CD146), una molecola di adesione della superfamiglia delle immunoglobuline presente sulla superficie cellulare, che regola le interazioni cellula–cellula, la dinamica delle giunzioni endoteliali e il rimodellamento del citoscheletro. Nei tessuti umani, Mel-CAM partecipa a processi legati alla biologia vascolare, tra cui l’attivazione endoteliale, la migrazione cellulare e la segnalazione angiogenica, e può interfacciarsi con vie che controllano la segnalazione dipendente dall’adesione e la permeabilità. Un’alterata espressione di MCAM è stata riportata in molteplici contesti patologici, dove viene spesso studiata in relazione all’invasività delle cellule tumorali, al comportamento metastatico e al rimodellamento infiammatorio della vascolatura. Queste caratteristiche rendono MCAM un bersaglio utile per analizzare i meccanismi di adesione, motilità e dialogo con il microambiente in modelli cellulari pertinenti.

Mel-CAM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MCAM senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Mel-CAM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MCAM nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MCAM, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Mel-CAM. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MCAM nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Mel-CAM nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Mel-CAM nelle cellule tumorali con espressione di MCAM silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.