MDR1/ABCB1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422215-ACT

Il gene murino **Abcb1b** codifica il trasportatore di resistenza ai farmaci **MDR1/ABCB1**, una pompa di efflusso della famiglia **ABC (ATP-binding cassette)** che limita l’accumulo intracellulare di xenobiotici e metaboliti strutturalmente diversi. Accoppiando l’idrolisi dell’ATP all’esportazione dei substrati, MDR1 influisce sulle barriere farmacocinetiche e sui programmi cellulari di detossificazione, modellando processi quali il trasporto epiteliale, la funzione delle barriere sangue–tessuto e le risposte allo stress da insulti tossici. La sua attività si intreccia con la segnalazione infiammatoria e metabolica attraverso la regolazione dell’esposizione intracellulare a lipidi di segnalazione e sostanze chimiche ambientali, ed è spesso studiata nel contesto della disposizione dei farmaci e dei fenotipi di multiresistenza. Un’espressione deregolata di MDR1/ABCB1 è rilevante nei modelli di malattia refrattaria al trattamento e negli studi meccanicistici sulla biodisponibilità mediata da trasportatori in vivo.

MDR1/ABCB1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Abcb1b senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MDR1/ABCB1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Abcb1b nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Abcb1b, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MDR1/ABCB1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Abcb1b nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MDR1/ABCB1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MDR1/ABCB1 nelle cellule tumorali con espressione di Abcb1b silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.