MBD4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403156-ACT

La MBD4 umana (methyl-CpG binding domain protein 4) è una DNA glicosilasi che riconosce i mismatch T:G e U:G derivanti dalla deaminazione in siti CpG metilati e avvia la riparazione per escissione di basi per mantenere l’integrità del genoma. Accoppiando il riconoscimento del metil-CpG all’escissione della lesione, MBD4 collega il contesto epigenetico con la riparazione del DNA e contribuisce a sopprimere l’accumulo di mutazioni nei dinucleotidi CpG. L’attività di MBD4 interseca processi di riparazione associati alla replicazione e di risposta al danno che modellano gli spettri mutazionali e la stabilità cromosomica. Alterazioni della funzione o dell’espressione di MBD4 sono state associate a fenotipi di ipermutazione e a instabilità genomica osservati in diversi contesti rilevanti per il cancro, a supporto della sua utilità nello studio dei meccanismi di mutagenesi.

MBD4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MBD4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MBD4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MBD4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MBD4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MBD4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MBD4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MBD4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MBD4 nelle cellule tumorali con espressione di MBD4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.