Mast Cell Chymase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403686-ACT

CMA1 codifica la chimasi dei mastociti, una serin-proteasi secreta di tipo chimotripsina-simile, immagazzinata nei granuli dei mastociti e rilasciata durante la degranulazione. La chimasi partecipa al rimodellamento della matrice extracellulare e al processamento di peptidi bioattivi, influenzando la segnalazione infiammatoria locale e il tono vascolare nei microambienti tissutali. La sua attività si integra con vie guidate dai mastociti che coinvolgono recettori attivati da proteasi, reti di citochine/chemochine e programmi di rimodellamento associati alla fibrosi. Un’espressione disregolata di CMA1 o un’alterata attività della chimasi sono state collegate a infiammazione allergica, asma, rimodellamento cardiovascolare e patologie fibrotiche di cute e polmone, rendendolo un utile bersaglio molecolare per studi meccanicistici della biologia dei mastociti.

Mast Cell Chymase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CMA1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Mast Cell Chymase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CMA1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CMA1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Mast Cell Chymase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CMA1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Mast Cell Chymase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Mast Cell Chymase nelle cellule tumorali con espressione di CMA1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.